ВЕРОЯТНЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ НА ЖИВЫЕ КЛЕТКИ *

В.В. Демин 1, В.А. Терентьев 2, Ю.А. Завгородняя 3, М.В. Бирюков 3

1 Институт Почвоведения МГУ-РАН, Москва
2 Всероссийский НИИ рыбного хозяйства и океанографии, Москва
3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва

Рассматривая роль гуминовых веществ (ГВ) в биосфере, исходят из того, что эти соединения являются не случайным продуктом постмортальных превращений биомассы, а необходимым звеном в эволюции биосферы, важнейшим фактором устойчивости жизненных процессов. Из ряда функций, выполняемых гуминовыми веществами – аккумулятивной, транспортной, регуляторной, протекторной, мы рассмотрим физиологическую, т.е. способность гуминовых веществ вызывать определенные реакции при их взаимодействии с живыми организмами.

Мы полагаем, что механизмы взаимодействия живых клеток с полимерами нерегулярного строения типа гуминовых кислот начали формироваться на самых первых этапах возникновения живых организмов и законченное развитие получили с появлением клеток эукариот.

Полимеры нерегулярного строения появились раньше живых организмов и в дальнейшем сосуществовали с ними. Одними из первых соединений этого типа были меланоидины – продукты аминосахарной реакции (рис. 1). Позднее, в ходе предбиологической эволюции или на первых этапах биологической эволюции, могли возникнуть соединения близкие по строению к современным гуминовым кислотам океанов (рис. 2). Наиболее «молодыми» в ряду природных полимеров нерегулярного строения являются собственно гуминовые вещества (рис. 3), синтез современных аналогов которых протекает в континентальных экосистемах. Начало их формирования связано с появлением наземных растений, в составе которых появляются протолигнины – предшественники лигнинов современных высших растений.

Все три группы соединений обладают рядом общих свойств: способны к гидрофильно-гидрофобным взаимодействиям, обладают антирадикальной, антиоксидантной и радиопротекторной активностью, могут выступать в качестве лигандов для ионов металлов. Эти полимеры обладают мембранотропными свойствами, проявляют слабовыраженную ферментативную активность. Нерегулярные полимеры несут фрагменты, которые организмы могут использовать как источник энергии или в качестве строительных блоков при синтезе клеточных компонентов.

Таким образом, жизнь возникла и развивалась на фоне постоянного присутствия во внешней среде нерегулярных полимеров. Логично предположить, что в ходе эволюции организмы каким-то образом «учитывали» этот факт. Достижения подобной коэволюции должны быть закреплены в химическом составе, строение и особенностях функционировании живых клеток.

Существующие гипотезы, объясняющие природу биологического действия гуминовых веществ, объединяет предположение о том, что ГВ могут выступать в качестве непосредственных участников метаболических путей живой клетки. Однако авторы не приводят конкретных механизмов реализации тех или иных свойств ГВ.

Анализ литературы позволяет выявить серьезное противоречие между двумя группами фактов. Многочисленные работы указывают, с одной стороны, на существование положительных биологических эффектов при взаимодействии ГВ с живыми организмами, однако, с другой стороны, анализ данных о химическом строении гуминовых веществ, их воздействии на ферменты, показывает, что гуминовые вещества обладают свойствами, которые делают их крайне неудобным «соседом» для живой клетки. Причем это именно те свойства, с которыми связывают положительное биологическое действие ГВ:

  1. наличие в молекулах ГВ активных центров, способных к эффективному связыванию ионов металлов, которое приводит, в случае попадания этих молекул в цитоплазму, к атаке активных центров металло-ферментов и их ингибированию;
  2. наличие в молекулах ГВ участков, несущих неспаренные электроны, которое может явиться причиной реакций, приводящих к модификации компонентов клетки из-за ковалентной прививки к ним молекул ГВ;
  3. амфифильные свойства молекул ГВ, которые делают возможным межмолекулярные взаимодействия ГВ с компонентами клетки в результате образования водородных, кулоновских и гидрофобных связей. Легко предположить, что межмолекулярные взаимодействия клеточных компонентов с такой молекулой-«гостем», должны привести к нарушению клеточного метаболизма.

Устранить это противоречие мы и попытались с помощью предлагаемой гипотезы.

Можно предположить, что современные живые организмы, с одной стороны, обладают способностью нивелировать возможные негативные эффекты присутствия во внешней среде гуминовых веществ, а с другой – эффективно использовать возможности сосуществования с ними.

Живые организмы, по нашему мнению, эти проблемы решили следующим образом.

  1. Химическое строение и пространственная организация клеточных стенок позволяет эффективно связывать полимеры нерегулярного строения.
  2. Клеточные мембраны не пропускают высокомолекулярные полимеры нерегулярного соединения и достаточно устойчивы к природным полимерам-детергентам.
  3. Гетеротрофное питание осуществляется в результате эндоцитоза. Нерегулярные полимеры могут захватываться либо отдельно в результате неспецифического эндоциоза, либо совместно с регулярными биополимерами – белками, нуклеиновыми кислотами и др.

Поступление молекул ГВ в клетку представляется маловероятным, поскольку предполагает прохождение ими таких барьеров, как клеточная стенка и плазматическая мембрана (рис. 4).

Эффективный диаметр пор в клеточной стенке корней растений варьирует в пределах от 3.5 до 5.2 нм, что очень сильно замедляет диффузию в них макромолекул, масса которых значительно превышает 15-20 КД a (Альбертс и др., 1987). Если исходить из известных размеров молекул гуминовых и фульвокислот, то можно сделать вывод, что при длине молекул 5.3-6.4 нм для фульвокислот и 9.4-10.7 нм для гуминовых кислот перенос этих соединений в клеточных стенках будет сильно затруднен. Переносу будут мешать:

  1. фиксация крупных молекул ГВ на поверхностях каналов в клеточной стенке, уменьшающая эффективный диаметр пор;
  2. отрицательный заряд, существующий в клеточной стенке и вызывающий ионную эксклюзию отрицательно заряженных молекул ГВ;
  3. эффективное связывание с компонентами клеточной стенки за счет многочисленных водородных и гидрофобных взаимодействий.

Перенос ГВ через клеточную мембрану фактически невозможен, так как пассивный транспорт через поры в мембране затруднен даже для гидратированных ионов К + диаметром 0.34 нм, а облегченная диффузия и активный транспорт являются субстат-специфическими процессами.

На рисунке 5 представлены результаты экспериментов по абсорбции гуминовых кислот клетками дрожжей. Связывание гуминовых кислот клеточными стенками протекает эффективно уже при низких концентрациях гуминовых кислот во внешней среде, близких к тем, которые существуют в природных водах. Расчеты показывают, что в этих условиях на поверхности и частично в объеме клеточных стенок уже может формироваться мономолекулярный слой из молекул гуминовых кислот.

Образующийся на поверхности клеток слой из молекул гуминовых кислот можно рассматривать как активный сетчатый фильтр, способный связывать токсиканты, которые взаимодействуют с гуминовыми кислотами, например детергент додецилсульфат натрия (ДДС- Na), диспергирующий клеточные мембраны и пропускать не реагирующие с гуминовыми кислотами соединения, такие как азид натрия, действующий как дыхательный яд. Наиболее наглядно этот эффект проявляется при разной последовательности внесения ядов и гуминовых кислот в культуральную среду (рис. 6). Если для азида натрия последовательность внесения реагентов не изменяет величину биологического эффекта гуминовых кислот, то в случае детергента ДДС- Na положительный эффект выше в том случае, когда гуминовые кислоты вносятся в систему до добавления яда и успевают сформировать фильтр на поверхности клеток.

Если говорить о механизме переноса молекул гуминовых веществ внутрь клетки, то можно предложить путь поступления ГВ в клетки, основываясь на теории переноса и внутриклеточного переваривания крупных молекул и частиц, предложенной Кристианом де Дювом (1964). Этот путь переноса исключает, что принципиально важно, непосредственный контакт молекул ГВ с компонентами клетки. Захват клетками крупных молекул ГВ осуществляется в результате эндоцитоза, дальнейшее их переваривание происходит в пищеварительных вакуолях, образующихся после слияния эндоцитарных пузырьков с лизосомами (рис. 7). Все основные классы биополимеров, входящих в «периферическую часть» молекул ГВ или нековалентно захваченные ими (белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, липиды) разлагаются ферментами, содержащимися в лизосомах. Образующиеся в результате ферментативного гидролиза аминокислоты, сахара, нуклеотиды диффундируют в цитоплазму и включаются в метаболические процессы. Непереваренные остатки ГВ (в основном, «ядерная часть») выводятся из клетки в ходе экзоцитоза.

Именно процессом частичного внутриклеточного переваривания объясняются положительные результаты многочисленных экспериментов по обнаружению меченных гуминовых кислот внутри клетки.

На наш взгляд, биологическое действие ГВ на живые организмы обусловлено тем, что интактные молекулы ГВ и высокомолекулярные остатки их внутриклеточного переваривания локализуются в клеточных стенках или в слое, непосредственно примыкающем к цитоплазматической мембране. Таким образом, на поверхности живой клетки возникает подобие активного ажурного фильтра, способного выполнять следующие функции:

  1. перехватывать ионы тяжелых металлов, связывая их в устойчивые комплексы хелатного типа;
  2. перехватывать молекулы ксенобиотиков;
  3. связывать свободные радикалы, образующиеся в плазматической мембране, в результате перекисного окисления липидов.

Высокомолекулярные продукты внутриклеточного переваривания ГВ, лишенные периферических компонентов, могут выполнять эти функции даже более эффективно, чем интактные молекулы, так как исчезают стерические препятствия для контакта ионов и свободных радикалов с соответствующими активными центрами молекул ГВ. Не исключено, что в процессе внутриклеточного переваривания гуминовых кислот, а также при прохождении их через клеточные стенки, могут возникать низкомолекулярные осколки ГВ, являющиеся самостоятельными биологически активными соединениями, действующими на живую клетку.

На рисунке 8 представлена схема локализации протекторных свойств гуминовых кислот в почвенной среде. Способность гуминовых кислот связывать разнообразные токсиканты хорошо известна. Однако в многочисленных исследованиях защитное действие гуминовых кислот описывается реакциями, протекающими только в растворе или на границах раздела фаз. Мы полагаем, что в реальных почвенных условиях клеточные стенки микроорганизмов и корней высших растений постоянно пропитаны гуминовыми веществами, и именно эти фильтры являются важным барьером на пути поступления токсикантов внутрь живой клетки.

Общим результатом описанных взаимодействий ГВ с живыми клетками является высвобождение энергии, которая вместо того, чтобы расходоваться на компенсацию неблагоприятных воздействий внешней среды, может быть затрачена клеткой на рост и размножение, что в конечном итоге приводит к усилению конкурентоспособности данного организма, как на уровне популяции, так и при межпопуляционных отношениях. Вероятно, самым интересным в затронутой проблеме биологического действия ГВ является исследование возможности передачи ГВ или продуктов их трансформации по трофическим цепям или от родителей потомству и закрепления приобретенных под действием ГВ признаков в ДНК, т.е. речь, в конечном итоге идет об эволюционной необходимости гуминовых веществ в биосфере.

* Доклад был сделан на симпозиуме IX «Органическое вещество почвы в современных экосистемах» IV съезда Докучаевского общества почвоведов (Демин В.В., Терентьев В.А., Завгородняя Ю.А., Бирюков М.В. Вероятный механизм действия гуминовых веществ на живые клетки. Материалы IV съезда Докучаевского общества почвоведов. Новосибирск, 9-13 августа 2004г. – Новосибирск, Изд-во Наука-центр, 2004. – С. 494.)